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01明場（BF）

    明場成像是常用的顯微鏡觀察方式，適用于觀察生物樣品和材料樣品。當你次通過明場觀察時，你可能會看到透射光下呈現紫色的洋蔥表皮細胞，這在生物課上的是很平常的體驗。

    此外，在生物研究中，常使用明場成像進行免疫組化染色。不同標記方式可以呈現不同顏色的樣本，也可以利用抗體標記或染料顯色來區分不同組分。

▲HE染色和TMA標本中的DAB染色

雖然明場成像方法簡單有效且成本低，但由于其標記成分數量有限，因此應用范圍相對較窄，并且對比度不太明顯，難以判斷陽性結果。

   觀察不透明的材料樣品時，反射光明場是常用的觀察方式。這種方法通過直接照射光源于樣品表面，樣品表面的結構對光的反射和吸收程度不同，從而形成具有亮暗差異的圖像，反映了樣品表面的粗糙度和吸光情況。

02暗場（DF）

    暗場成像與明場成像相對應。在暗場成像中，我們并不能直接觀察到照明光線，而是將光線斜射到標本的表面上。根據丁道爾（Tyndall）現象，微粒會對斜射光進行反射或衍射，從而增強了這些微小物體的可見性，使我們能夠觀察到它們。

    通過采用暗場成像技術，我們可以有效地突出微小物體的細節和特征，甚至在標本背景較為復雜或樣本透明性較高的情況下，仍能夠清晰地觀察到它們。這種觀察方式對于研究微生物、細胞結構以及其他需要突出微小物體的應用領域非常有價值。

    實現暗場成像的方法如下：首先，通過顯微鏡剖面圖我們可以看到，聚光鏡會以一個特定的高度角將光錐對準標本，這樣部分光線就不會直接進入物鏡。

    在暗場成像中，標本的光經過衍射、反射和折射等光學效應后，再次進入物鏡。這些效應是由光學不連續物（如細胞膜、細胞核和內部細胞器）引起的。由于這些效應的存在，標本的光被散射和重定向，進入物鏡。此時，標本表現為明亮的物體，而周圍則是黑色背景。

    通過這種方式，暗場成像能夠突出物體的輪廓和細節，使其更加清晰可見。

    總的來說，暗場成像適合觀察微小粒子、細菌形態、細菌計數、透明標本等，并能夠顯示標本的細微結構。

    然而，暗場成像也存在一些限制。首先，物體散射的光會影響成像，降低對比度并使標本細節模糊。此外，標本中的灰塵和碎片也會對生成的圖像產生影響。

    同時，對于較薄的貼壁細胞來說，信號通常較弱。而對于較厚的植物和動物組織，它們會將過多的光線重新定向到物鏡內，從而降低成像的對比度。因此，暗場成像對標本的要求較高。

    材料樣品的暗場結構與生物樣品稍有差異（參考左下方圖）。反射光暗場可以呈現樣品表面的超微小結構，能夠觀察到0.004um以下的細節。然而，由于微小結構會導致光的散射或衍射，因此在暗場條件下無法進行準確測量，僅適合用于觀察和定位一些微小結構和缺陷。此外，反射光暗場還可用于獲取透明或半透明材料的顏色信息，例如 PCB 板上的綠色油漆、鐵銹的色彩等。

03相差（PH）

    差顯鏡（相差顯微鏡）是一種常用的觀察方法，特別適用于活細胞成像。在明場觀察下，細胞輪廓通常不清晰，無法分辨其邊界和內部結構。

    差顯鏡利用光程差（相位差）的技術，將光通過不同厚度的標本時產生的光程差轉化為可見的明暗變化，從而使得標本的結構得以區分。這種技術利用了人眼無法感知的相位信息，提供了對細胞結構的更好觀察。

    從原理圖中可以看出，相差成像的關鍵在于確保聚光鏡和相差物鏡之間的相差環匹配。當觀察或成像培養的活細胞時，相差成像是一種有效增強對比度的方法。然而，它通常會導致邊緣特征周圍出現光暈，這些光暈實際上是光學偽影，會降低邊界細節的可見性。

    此方法在處理厚標本方面并不適用，因為一旦遠離焦平面，相位會發生變化，導致圖像細節的扭曲。此外，浮動的碎片和其他失焦物體可能會干擾貼壁細胞的成像。

    隨著熒光技術的進展，相差成像方式和熒光成像雖可以同時進行，但相差環的存在會降低熒光透過率，對于弱熒光樣品的成像并不有利。

04偏光（POL）

    偏光顯微鏡由于其高靈敏度，可用于對不同各向異性樣品進行定性和定量研究。定性偏振光顯微鏡在實際應用中非常普遍，然而偏振光顯微鏡的定量方面主要應用于晶體學、礦物學、地質學和化學等領域。

    偏振光顯微鏡通過在聚光鏡之前和物鏡之后插入交叉偏振器件來實現。細胞內具有雙折射特性的組分會旋轉光的偏振平面，從而在深色背景上呈現出明亮的特征。

    在過去幾年中，高靈敏度偏振光顯微鏡取得了穩定的進展，使得生物學家能夠檢測各向異性亞細胞組件的雙折射特性。這種技術被應用于骨骼、牙齒、膽固醇、神經纖維、腫瘤細胞、橫紋肌以及毛發等的研究中。

    對于不透明的材料樣品，也可以利用偏振光觀察進行分析，但需要使用反射光偏光模式。這種方法可以用來分析材料的雙折射性，并且結合特殊的制備樣品技術，還可以區分材料中晶體顆粒的晶體取向。

05微分干涉(DIC)

    微分干涉（DIC）是七種觀察方式中復雜的一種。其光路不僅包括偏振組件，還包括一組特制棱鏡，用于放大樣品厚度梯度和折射率微小差異。例如，由于細胞中水相和脂質相之間的折射率差異，DIC可以產生出色的對比度，尤其在顯示脂質雙層時。

    此外，對于較平坦的貼壁哺乳動物和植物細胞，包括細胞質膜、細胞核、液泡、線粒體和壓力纖維等，這些細胞邊界通常具有顯著的梯度，非常適合進行DIC成像。

    在植物組織中，雙折射的細胞壁可能會降低DIC的對比度，但仍然可以顯示表皮細胞中的核膜、液泡膜、某些線粒體、葉綠體和凝聚的染色體等結構。與相差成像相比，DIC的成像效果能夠避免細胞邊緣的光暈現象。

    微分干涉成像可以給樣品帶來立體感，使觀察效果更加直觀。然而，微分干涉的光路配件較為復雜，調節難度也較大。另外，由于微分干涉是基于偏振光原理，對于高雙折射樣品或嵌入雙折射材料的樣品，并不適合進行微分干涉觀察。這些樣品可能會引起干涉圖案的扭曲或干擾，從而影響成像質量。

    盡管微分干涉無法用于塑料皿內樣品的觀察，但是塑料皿非常適合進行細胞培養。通過蔡司獨有的PlasDIC技術，我們可以在塑料皿中對活細胞進行微分干涉觀察。

    材料樣品方面，微分干涉（DIC）觀察方式逐漸受到更多關注和歡迎。然而，對于那些具有多個方向結構的材料而言，DIC已經無法滿足其觀察需求。蔡司提出的圓微分干涉技術通過使用圓偏振光替代線偏振光，能夠一次性成像樣品上360度不同取向的結構，避免了繁瑣的樣品旋轉過程。這種新技術極大地簡化了觀察過程，并提供了更全面的信息。

06霍夫曼調制相差（HMC）

    霍夫曼調制相差（HMC）利用斜入射光照射樣本，通過折射和衍射現象，在物鏡光密度梯度調節器的作用下產生不同陰影，從而在透明樣本表面形成明暗對比，增強觀察效果。

與其他技術相比，霍夫曼調制相差不會受到使用雙折射材料的光路中的限制，因此在檢查聚合材料容器中的樣本時更為有用。

然而，該方法存在一個不利之處，即HMC會產生許多光學偽像，因此在貼壁細胞成像或在玻璃蓋片上進行觀察時，其效果可能不如相差或DIC技術。

這里補充一點，還有一種新開發的觀察技術，可看作相差與傾斜單邊照明的結合（類似于HMC），用于檢查培養容器中的活細胞。

    斜射光照射標本時會發生折射和衍射現象，通過物鏡相襯板的作用，產生不同的陰影效果，從而在透明標本表面形成明暗差異，增加觀察對比度。

07熒光成像（FL）

    熒光成像在當前的科研中得到廣泛應用。無論是熒光免疫組化染色、融合蛋白轉基因表達還是熒光染料染色，這些方法對于蛋白質的定位和定量分析、細胞的動態變化以及組織結構的觀察具有重要影響。熒光成像技術為我們提供了一種高度敏感且可視化的工具，使得我們能夠深入研究蛋白質的共定位關系以及其在細胞和組織水平上的功能。

    熒光成像的原理基于熒光分子在吸收能量后從激發態躍遷回基態時釋放出的熒光信號。這種激發狀態可以通過不同種類的光源來實現，比如普通熒光顯微鏡所使用的金屬鹵化物燈、LED熒光燈，以及共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡所使用的激光等。當熒光分子受到合適波長的激發光照射后，它們吸收能量并被激發到高能態，然后在經過一段時間后返回基態，并釋放出熒光信號。這些熒光信號可以被探測器捕獲并轉換為可視化的圖像，以實現對樣品中熒光標記物的定位和觀察。

需要記住的是，不同的熒光成像方式適合不同的研究對象：

✓ 由于sCOMS相機的快速成像特點，在鈣成像上普通熒光顯微鏡具有速度優勢。

✓ 共聚焦的信噪比和分辨率特點適合多色高分辨高對比成像。

✓ 利用雙光子光漂白少的特性，對活細胞或活體動物成像具有顯著優勢。

✓ 利用不同的染料和熒光蛋白特性，還可以進行更多更復雜的熒光成像實驗。

    材料樣品也具有自發熒光的特性，不像生物樣品那樣需要特定染料進行標記。這使得我們能夠直接觀察材料樣品的多彩一面。例如，樹脂材料、纖維等樣品常常展示出自發熒光的特點。利用這種特性，我們可以在科研和生產中應用熒光成像技術對樣品進行缺陷檢測等操作，從而為質量控制和產品開發提供保障。熒光成像技術在材料科學領域的應用不僅豐富了我們對材料性質的理解，還推動了材料研究與生產的進展。